----> torna pagina degli articoli
SUMMARY
Purpose
The aim of this study was to evaluate, in vitro, the survival
and growth rates of transversely sectioned human hair follicles
to assess experimentally the soundness of this approach as a future
possible method for “duplicating” available donor
hair grafts.
Methods
A total of 300 human anagen hair follicles was obtained from 10
male patients. Follicles were thus randomly assigned to group
A (100 follicles), cultured intact as dissected, and group B (200
follicles), transversely transected, parallel to the epidermal
surface and immediately below to the bulge area, to obtain 200
lower-half follicles and 200 upper-half follicles. Isolated hair
follicles from both groups were maintained in culture for 10 days.
Results
The lenght of each follicle was measured immediately following
isolation and at the end of the 10-day culture period. No differences
were found between the growth rate of intact follicles (mean=
2,71 mm) and of lower-half follicles (mean = 2,64), whereas a
statistically significant difference was found between the growth
rate of follicles from the 2 above-mentioned groups and the growth
rate of the “upper-half follicles” (mean = 1,07).
Discussion
Histologic analysis demonstrated that in upper-half follicle sections
we invariably detected a region of intence cell proliferation,
reminiscent of a regenerated follicular papilla, surrounding the
lower-most part of the follicle.
Conclusions
The reported in vitro survival rate of transected human hair follicles
might represent an interesting starting point in striving to augment
the number of donor hairs available during an hair transplantation
procedure.
INTRODUZIONE
Il trapianto di capelli per la correzione della calvizie è
oramai la più comune procedura di chirurgia plastica estetica
eseguita in pazienti di sesso maschile. La quantità di
tessuto donatore per la ricrescita permanente di capelli è
il più importante fattore sia per la riuscita sia per la
realizzabilità dell'intervento. Quando l' innesto viene
isolato, generalmente si raccomanda (1) (2) di includere nel prelievo
il bulbo pilifero, cercando di non danneggiarlo in modo tale da
permettere la vitalità e la ricrescita dei capelli trapiantati.
Infatti, in passato, si era ipotizzato che il centro germinativo
del follicolo pilifero fosse esclusivamente localizzato nella
zona del bulbo e che le cellule staminali follicolari fossero
localizzate nella matrice (3). Di recente, invece, Alcuni Autori
(4) (8) hanno ipotizzato che le cellule staminali follicolari
siano localizzate anche nella “bulge area” del follicolo
pilifero. La “bulge area” del follicolo è in
prossimità dell'inserzione del muscolo erector pili ed
è localizzata presso la metà longitudinale del follicolo.
Secondo questa ipotesi, l'incisione trasversale del follicolo
al di sotto della “bulge area” dovrebbe permettere
di ottenere due innesti vitali di capelli (ognuno provvisto di
un centro germinativo) da un capello donatore, duplicando così
il numero di capelli innestabili. Infatti, ogni metà del
follicolo sezionato dovrebbe contenere una “riserva”
di cellule staminali follicolari teoricamente atta a ricostituire
una completa struttura follicolare in grado di garantire una normale
ricrescita del capello.
Lo scopo di questo studio è stato di valutare, in un modello
in vitro, il tasso di vitalità e di crescita follicolare
di capelli sezionati trasversalmente al fine di evidenziare sperimentalmente
la validità di questa tecnica come futuro e possibile metodo
per la duplicazione del numero di capelli innestabili.
MATERIALI E METODI
Sono stati prelevati alcuni campioni di scalpo occipitale da 10
pazienti di sesso maschile, in buona salute (di età compresa
tra 28 e 42 anni) durante escissioni di routine di lesioni benigne
dello scalpo (ad esempio cisti e nevi). L'isolamento di follicoli
di capelli è stato realizzato mediante bisturi e forbici
microchirurgiche, utilizzando un microscopio operatore (Axioskop
MC100-Zeiss, Oberkochen, Germania). Come nella preparazione di
microinnesti per la tecnica di trapianto di capelli, ogni follicolo
è stato isolato intatto, mantenendo sempre una parte significativa
di tessuto (epidermico, dermico, sottocutaneo) per tutta la lunghezza
del follicolo. Tecniche alternative per l'isolamento dei follicoli
(come la digestione della cute con collagenasi) si sono rivelate
inadeguate a fornire follicoli capaci di garantire la crescita
del capello dal momento che il mantenimento dell'integrità
strutturale del follicolo e delle strutture correlate è
un requisito essenziale per la crescita in vitro (9). Sono stati
scartati tutti i follicoli visibilmente danneggiati durante la
dissezione. Sono stati ottenuti un totale di 300 follicoli (30
follicoli per ogni campione). I follicoli (n = 30) di ognuno dei
10 campioni di scalpo occipitale sono stati assegnati casualmente
ad uno dei seguenti gruppi: gruppo A (controllo; n = 10 follicoli
per ogni campione; totale n = 100 follicoli), coltivati intatti
come isolati, e gruppo B (sperimentale; n = 20 follicoli per ogni
campione di scalpo; totale: n = 200 follicoli) incisi trasversalmente
parallelamente alla superficie epidermica, subito al di sotto
della “bulge area”, per ottenere 200 emi-follicoli
dalla metà inferiore e 200 emi-follicoli della metà
superiore. I follicoli isolati da entrambi i gruppi sono stati
mantenuti in 500 ºl di soluzione Williams E (Sigma-Aldrich,
Milano) con aggiunta di quanto segue: 1% di siero fetale di vitello,
10 ºg/ml di transferrina, 10 ºg/ml di insulina, 10 ng/ml
di sodio selenite, 10 ng/ml di idrocortisone, 100 unità/ml
di penicillina, 100 ºg/ml di streptomicina, 2,5 ºg/ml
di fungizone (10). Il mezzo è stato preparato immediatamente
prima degli esperimenti e cambiato ogni 72 ore. I follicoli sono
stati mantenuti liberi di galleggiare nelle cellette individuali
di piastre da 24 cellette ad una temperatura di 37° C, con
un atmosfera di 5% di CO2, 95% di aria e 100% di umidità.
Questo modello ha consentito di effettuare misurazioni dettagliate
della lunghezza dei singoli follicoli. La lunghezza di ogni follicolo
è stata misurata ad un ingrandimento di 20, dopo l'isolamento
ed alla fine dei 10 giorni del periodo di coltura, usando un microscopio
con un graticolo graduato (Wild M10-Leica, Heerbrugg, Switzerland).
La lunghezza totale del follicolo è stata calcolata come
la distanza dalla base del bulbo alla fine del fusto del capello.
I follicoli, che avevano perso la normale struttura in seguito
a degenerazione avvenuta durante il periodo di coltura, non sono
stati misurati. L'esame istologico è stato effettuato alla
fine del periodo di coltura, fissando i follicoli in una soluzione
salina (pH 7.4) di paraformaldeide 10%, includendoli in cera di
paraffina, ottenendo sezioni di 10 ºm di spessore e procedendo
con la colorazione secondo il protocollo modificato “Azam
trichromic” di Heidenheins (11). Questo procedimento produce
una colorazione in rosso dei nuclei e dell'interno della radice
della guaina, in rosa della papilla del follicolo, blu scuro della
matrice, viola del collagene, arancione del tessuto muscolare
e giallo chiaro della corteccia del capello, permettendo una dattagliata
analisi istologica dei follicoli coltivati. I dati ottenuti sono
stati analizzati statisticamente con il test Anova di Kruskal-Wallis.
Abbiamo scelto di usare questo test non parametrico in quanto
i risultati ottenuti non erano normalmente distribuiti; inoltre
abbiamo considerato la crescita nelle metà superiori ed
inferiori dei follicoli come non correlate (trattandole come campioni
indipendenti) poiché, secondo la nostra ipotesi, dovrebbero
essere basate sulla replicazione di differenti popolazioni cellulari
localizzate in aree differenti e separate del follicolo (la bulge
ed il bulbo, rispettivamente).
RISULTATI
La maggior parte dei follicoli prelevati (90,7%) sono cresciuti
ed hanno conservato la loro morfologia per l'intero periodo (10
giorni) della coltura. Non sono state rilevate differenze statisticamente
significative tra la percentuale di follicoli rimasti vitali (considerata
come il mantenimento della normale struttura follicolare e l'assenza
di segni di degenerazione) del gruppo di controllo A (92%; 92
di 100 follicoli) e gli emi-follicoli sia della metà superiore
(91%; 182 di 200 follicoli) sia della metà inferiore del
gruppo sperimentale B (89%; 178 di 200 follicoli). Le fotografie
scattate ai follicoli appena isolati e conservati hanno mostrato
che la crescita in lunghezza durante i 10 giorni di coltura non
è stata associata ad alcuna degenerazione della struttura
del follicolo. La crescita in lunghezza si è verificata
sempre a partire dalla produzione del fusto cheratinizzato. Tutti
i follicoli hanno prodotto un allungamento misurabile del fusto
e non sono state rilevate differenze significative tra la percentuale
di crescita di follicoli intatti (tasso di crescita di 10 giorni:
2,71 mm) e gli emi-follicoli della metà inferiore (tasso
di crescita di 10 giorni: 2,64 mm). D'altronde, una differenza
statisticamente significativa è stata rilevata fra il tasso
di crescita dei follicoli dei gruppi sopra menzionati e quella
degli emi-follicoli della metà superiore (tasso di crescita
di 10 giorni: 1,07 mm). L'analisi istologica ha dimostrato che
sia i follicoli integri sia quelli della metà inferiore
hanno mantenuto un normale aspetto istologico, anche dopo 10 giorni
di coltura. Nelle sezioni degli emi-follicoli della metà
superiore, abbiamo invariabilmente rilevato una regione di intensa
proliferazione cellulare attorno alla porzione inferiore del follicolo:
le cellule proliferanti hanno dato origine a strutture somiglianti
ad una papilla follicolare rigenerata, suggerendo che gli emi-follicoli
della metà superiore potrebbero così essere capaci
di rigenerare un follicolo completo e vitale.
DISCUSSIONE
Si ritiene che tutti i tessuti auto-rinnovatisi contengano una
popolazione di cellule staminali. Il follicolo del capello è
un sistema auto-rinnovantesi nel quale la perdita delle cellule
epiteliali, dovuta alla differenziazione terminale, è bilanciata
dalla formazione continua di nuove cellule (3). Alcune osservazioni
hanno suggerito come le cellule germinali del follicolo siano
situate sia nel bulbo sia in prossimità della bulge area
della radice, vicino l'inserzione del muscolo erector pili. A
questo proposito, vale la pena notare che dal momento che essendo
riassorbita e rigenerata durante ogni ciclo del capello, la regione
inferiore del follicolo (porzione sottostante la bulge area) è
transitoria, mentre la porzione superiore del follicolo rimane
intatta durante tutto il ciclo del capello. Un' implicazione di
questa ipotesi è che il movimento cellulare nella guaina
esterna della radice si verifichi per lo più verso il basso
piuttosto che verso l'alto della matrice. Inoltre, il concetto
che le cellule staminali risiedano anche nella regione vicina
al bulge, aiuta a capire alcuni aspetti della patologia del follicolo;
nell'alopecia cicatriziale, per esempio, l'infiltrato infiammatorio
interessa la parte superiore del follicolo estendendosi fino all'inserzione
dell'erettore, includendo così una delle regioni putative
di cellule staminali (12). D'accordo con questa ipotesi, Oliver
(6) ha dimostrato che le vibrisse del topo possono rigenerare
dopo che è stato rimosso chirurgicamente il terzo inferiore
del follicolo; l'esame morfologico del follicolo rigenerato ha
rivelato che si forma una nuova papilla dermica, originatasi apparentemente
dalla guaina del rimanente tessuto connettivo. Allo stesso modo,
Inaba et al. (4), Kim e Choi hanno osservato clinicamente come
follicoli, dai quali il bulbo e l'intera papilla sono stati escissi,
hanno rigenerato nuove papille e permesso la crescita di nuovi
capelli. Pertanto queste osservazioni dimostrano come la metà
superiore di un follicolo pilifero possa essere caratterizzata
da capacità rigenerative fino ad oggi attribuite solo al
bulbo. In questo studio sono state riportate le percentuali di
sopravvivenza e di crescita di follicoli piliferi umani bisezionati,
osservate utilizzando un modello in vitro affidabile, riproducibile
e quantificabile. I dati ottenuti concordano con quanto è
stato descritto da Rochat et al. (13) e Kobayashi et al. (14).
Esaminando la capacità di accrescimento di cheratinociti
isolati da follicoli piliferi umani e vibrisse di topo, essi hanno
determinato la posizione delle cellule atte alla formazione di
colonie di cheratinociti, scoprendo che le cellule suddette si
localizzano soprattutto a livello del bulge follicolare o immediatamente
al di sotto della stessa. Secondo la nostra esperienza, le cellule
follicolari attive per la formazione di colonie possono pertanto
essere considerate come cellule staminali follicolari. A nostro
avviso la percentuale riportata di sopravvivenza in vitro dei
follicoli sezionati potrebbe essere un interessante punto di partenza
per lo sviluppo di ulteriori studi clinici su questa metodica.
Sia i follicoli intatti che quelli della metà inferiore
hanno dimostrato una percentuale di crescita molto simile a quella
che si ha in vivo, circa 0,3 mm al giorno, mentre gli emi-follicoli
della metà superiore hanno mostrato una minor capacità
produttiva. La bassa percentuale di crescita dei follicoli della
metà superiore potrebbe essere correlata al fatto che un
certo intervallo di tempo sia richiesto dalle cellule staminali
della bulge area per generare la struttura istologicamente osservata,
che ricorda una papilla follicolare rigenerata e per promuovere
quindi la crescita di una nuova guaina.
CONCLUSIONI
Secondo i risultati ottenuti, un'interessante ipotesi speculativa
è rappresentata dalla possibilità di ricreare un'intera
struttura follicolare da singole cellule staminali follicolari.
In questo caso, potrebbe essere eventualmente possibile coltivare
cellule staminali follicolari in grado di offrire ai singoli pazienti
una quantità pressochè infinita di cellule staminali
potenzialmente capaci di generare follicoli. Questioni irrisolte
che emergono dal nostro studio in vitro di 10 giorni sono se la
sopravvivenza e la crescita dei follicoli bisezionati, così
come osservato in vitro, possano essere le stesse quando gli emi-follicoli
siano innestati come in una normale tecnica di trapianto di capelli,
e quale possa essere il comportamento a lungo termine di questo
tipo di innesti. Dal momento che, sfortunatamente, il massimo
periodo di sopravvivenza osservato per i capelli coltivati è
vicino ai 10 giorni, uno studio clinico della metodica in oggetto
risulta essere indispensabile per consentire un effettivo follow-up
a lungo termine di questa tecnica.
Bibliografia
1) Fan, J., Raposio, E., Nordstrom, REA. Minigraft preparation
in surgical hair replacement. Scand J Plast Reconstr Hand Surg.
31:83, 1997.
2) Unger, WP. Hair transplantation, 3rd Ed. New York: Marcel Dekker,
1995.
3) Lavker, RM., Miller, S., Wilson, C., et al. Hair follicle stem
cells: their location, role in hair cycle, and involvement in
skin tumor formation. J Invest Dermatol 101 (Suppl): 16S, 1993.
4) Inaba, M., Anthony, J., McKinstry, CT. Histological study of
the regeneration of axillary hair after removal with subcutaneous
tissue shaver. J Invest Dermatol 72: 224, 1979.
5) Kim, JC., Choi, YC. Regrowth of grafted human scalp hair after
removal of the bulb. Dermatol Surg 22: 312, 1995.
6) Oliver, RF. Whisker growth after removal of the dermal papilla
and lenghts of follicle in the hooded rat. J Embryol Exp Morphol.
15: 331, 1966.
7) Williams, D., stenn, KS. Transection level dictates the pattern
of hair follicle sheath growth in vitro. Dev biol 165: 469, 1994.
8) De Viragh, PA., Meuli, M. Human scalp hair follicle developement
from birth to adulthood: statistical study with special regard
to putative stem cell in the bulge and proliferating cells in
the matrix. Arch Dermatol Res 287: 279, 1995.
9) Bond, JJ., Wynn, PC., Brown GN.,Moore GPM. Growth of wool follicles
in culture. In Vitro Cell Dev Biol. 30 A: 90, 1994.
10) Philpott, MP., Green, MR., Kealey, T. human hair growth in
vitro. J Cell Sci. 97: 463, 1990.
11) Heidenhein, M. Uber die Mallorysche Bindegewebsfarbung mit
Karmin und Azokarmin als Vorfarben. Wissensch Mikr 32: 361, 1915.
12) Messenger, AG. The control of hair growth: an overview. J
Invest Dermatol 101 (Suppl): 4S, 1993.
13) Rochat, A., Kobayashi, K., Barrandon, Y. Location of stem
cells of human hair follicles by clonal analysis. Cell 76: 1063,
1994.
14) Kobayashi, K., Rochat, A., Barrandon, Y. Segregation of keratinocyte
colony-forming cells in the bulge of the rat vibrissa. Proc Natl
Acad Sci U.S.A. 90: 7391, 1993.
----> torna alla home page ----> torna pagina degli articoli