Bisezione follicolare nel trapianto chirurgico dei capelli
un modello in vitro
Edoardo Raposio, Eleonora Canini, Pierluigi. Santi
U.O. di Chirurgia Plastica, DICMI, Università degli Studi di Genova
SUMMARY
Purpose
The aim of this study was to evaluate, in vitro, the survival and growth rates of transversely sectioned human hair follicles to assess experimentally the soundness of this approach as a future possible method for “duplicating” available donor hair grafts.
Methods
A total of 300 human anagen hair follicles was obtained from 10 male patients. Follicles were thus randomly assigned to group A (100 follicles), cultured intact as dissected, and group B (200 follicles), transversely transected, parallel to the epidermal surface and immediately below to the bulge area, to obtain 200 lower-half follicles and 200 upper-half follicles. Isolated hair follicles from both groups were maintained in culture for 10 days.
Results
The lenght of each follicle was measured immediately following isolation and at the end of the 10-day culture period. No differences were found between the growth rate of intact follicles (mean= 2,71 mm) and of lower-half follicles (mean = 2,64), whereas a statistically significant difference was found between the growth rate of follicles from the 2 above-mentioned groups and the growth rate of the “upper-half follicles” (mean = 1,07).
Discussion
Histologic analysis demonstrated that in upper-half follicle sections we invariably detected a region of intence cell proliferation, reminiscent of a regenerated follicular papilla, surrounding the lower-most part of the follicle.
Conclusions
The reported in vitro survival rate of transected human hair follicles might represent an interesting starting point in striving to augment the number of donor hairs available during an hair transplantation procedure.
INTRODUZIONE
Il trapianto di capelli per la correzione della calvizie è oramai la più comune procedura di chirurgia plastica estetica eseguita in pazienti di sesso maschile. La quantità di tessuto donatore per la ricrescita permanente di capelli è il più importante fattore sia per la riuscita sia per la realizzabilità dell’intervento. Quando l’ innesto viene isolato, generalmente si raccomanda (1) (2) di includere nel prelievo il bulbo pilifero, cercando di non danneggiarlo in modo tale da permettere la vitalità e la ricrescita dei capelli trapiantati. Infatti, in passato, si era ipotizzato che il centro germinativo del follicolo pilifero fosse esclusivamente localizzato nella zona del bulbo e che le cellule staminali follicolari fossero localizzate nella matrice (3). Di recente, invece, Alcuni Autori (4) (8) hanno ipotizzato che le cellule staminali follicolari siano localizzate anche nella “bulge area” del follicolo pilifero. La “bulge area” del follicolo è in prossimità dell’inserzione del muscolo erector pili ed è localizzata presso la metà longitudinale del follicolo. Secondo questa ipotesi, l’incisione trasversale del follicolo al di sotto della “bulge area” dovrebbe permettere di ottenere due innesti vitali di capelli (ognuno provvisto di un centro germinativo) da un capello donatore, duplicando così il numero di capelli innestabili. Infatti, ogni metà del follicolo sezionato dovrebbe contenere una “riserva” di cellule staminali follicolari teoricamente atta a ricostituire una completa struttura follicolare in grado di garantire una normale ricrescita del capello.
Lo scopo di questo studio è stato di valutare, in un modello in vitro, il tasso di vitalità e di crescita follicolare di capelli sezionati trasversalmente al fine di evidenziare sperimentalmente la validità di questa tecnica come futuro e possibile metodo per la duplicazione del numero di capelli innestabili.
MATERIALI E METODI
Sono stati prelevati alcuni campioni di scalpo occipitale da 10 pazienti di sesso maschile, in buona salute (di età compresa tra 28 e 42 anni) durante escissioni di routine di lesioni benigne dello scalpo (ad esempio cisti e nevi). L’isolamento di follicoli di capelli è stato realizzato mediante bisturi e forbici microchirurgiche, utilizzando un microscopio operatore (Axioskop MC100-Zeiss, Oberkochen, Germania). Come nella preparazione di microinnesti per la tecnica di trapianto di capelli, ogni follicolo è stato isolato intatto, mantenendo sempre una parte significativa di tessuto (epidermico, dermico, sottocutaneo) per tutta la lunghezza del follicolo. Tecniche alternative per l’isolamento dei follicoli (come la digestione della cute con collagenasi) si sono rivelate inadeguate a fornire follicoli capaci di garantire la crescita del capello dal momento che il mantenimento dell’integrità strutturale del follicolo e delle strutture correlate è un requisito essenziale per la crescita in vitro (9). Sono stati scartati tutti i follicoli visibilmente danneggiati durante la dissezione. Sono stati ottenuti un totale di 300 follicoli (30 follicoli per ogni campione). I follicoli (n = 30) di ognuno dei 10 campioni di scalpo occipitale sono stati assegnati casualmente ad uno dei seguenti gruppi: gruppo A (controllo; n = 10 follicoli per ogni campione; totale n = 100 follicoli), coltivati intatti come isolati, e gruppo B (sperimentale; n = 20 follicoli per ogni campione di scalpo; totale: n = 200 follicoli) incisi trasversalmente parallelamente alla superficie epidermica, subito al di sotto della “bulge area”, per ottenere 200 emi-follicoli dalla metà inferiore e 200 emi-follicoli della metà superiore. I follicoli isolati da entrambi i gruppi sono stati mantenuti in 500 ºl di soluzione Williams E (Sigma-Aldrich, Milano) con aggiunta di quanto segue: 1% di siero fetale di vitello, 10 ºg/ml di transferrina, 10 ºg/ml di insulina, 10 ng/ml di sodio selenite, 10 ng/ml di idrocortisone, 100 unità/ml di penicillina, 100 ºg/ml di streptomicina, 2,5 ºg/ml di fungizone (10). Il mezzo è stato preparato immediatamente prima degli esperimenti e cambiato ogni 72 ore. I follicoli sono stati mantenuti liberi di galleggiare nelle cellette individuali di piastre da 24 cellette ad una temperatura di 37° C, con un atmosfera di 5% di CO2, 95% di aria e 100% di umidità. Questo modello ha consentito di effettuare misurazioni dettagliate della lunghezza dei singoli follicoli. La lunghezza di ogni follicolo è stata misurata ad un ingrandimento di 20, dopo l’isolamento ed alla fine dei 10 giorni del periodo di coltura, usando un microscopio con un graticolo graduato (Wild M10-Leica, Heerbrugg, Switzerland). La lunghezza totale del follicolo è stata calcolata come la distanza dalla base del bulbo alla fine del fusto del capello. I follicoli, che avevano perso la normale struttura in seguito a degenerazione avvenuta durante il periodo di coltura, non sono stati misurati. L’esame istologico è stato effettuato alla fine del periodo di coltura, fissando i follicoli in una soluzione salina (pH 7.4) di paraformaldeide 10%, includendoli in cera di paraffina, ottenendo sezioni di 10 ºm di spessore e procedendo con la colorazione secondo il protocollo modificato “Azam trichromic” di Heidenheins (11). Questo procedimento produce una colorazione in rosso dei nuclei e dell’interno della radice della guaina, in rosa della papilla del follicolo, blu scuro della matrice, viola del collagene, arancione del tessuto muscolare e giallo chiaro della corteccia del capello, permettendo una dattagliata analisi istologica dei follicoli coltivati. I dati ottenuti sono stati analizzati statisticamente con il test Anova di Kruskal-Wallis. Abbiamo scelto di usare questo test non parametrico in quanto i risultati ottenuti non erano normalmente distribuiti; inoltre abbiamo considerato la crescita nelle metà superiori ed inferiori dei follicoli come non correlate (trattandole come campioni indipendenti) poiché, secondo la nostra ipotesi, dovrebbero essere basate sulla replicazione di differenti popolazioni cellulari localizzate in aree differenti e separate del follicolo (la bulge ed il bulbo, rispettivamente).
RISULTATI
La maggior parte dei follicoli prelevati (90,7%) sono cresciuti ed hanno conservato la loro morfologia per l’intero periodo (10 giorni) della coltura. Non sono state rilevate differenze statisticamente significative tra la percentuale di follicoli rimasti vitali (considerata come il mantenimento della normale struttura follicolare e l’assenza di segni di degenerazione) del gruppo di controllo A (92%; 92 di 100 follicoli) e gli emi-follicoli sia della metà superiore (91%; 182 di 200 follicoli) sia della metà inferiore del gruppo sperimentale B (89%; 178 di 200 follicoli). Le fotografie scattate ai follicoli appena isolati e conservati hanno mostrato che la crescita in lunghezza durante i 10 giorni di coltura non è stata associata ad alcuna degenerazione della struttura del follicolo. La crescita in lunghezza si è verificata sempre a partire dalla produzione del fusto cheratinizzato. Tutti i follicoli hanno prodotto un allungamento misurabile del fusto e non sono state rilevate differenze significative tra la percentuale di crescita di follicoli intatti (tasso di crescita di 10 giorni: 2,71 mm) e gli emi-follicoli della metà inferiore (tasso di crescita di 10 giorni: 2,64 mm). D’altronde, una differenza statisticamente significativa è stata rilevata fra il tasso di crescita dei follicoli dei gruppi sopra menzionati e quella degli emi-follicoli della metà superiore (tasso di crescita di 10 giorni: 1,07 mm). L’analisi istologica ha dimostrato che sia i follicoli integri sia quelli della metà inferiore hanno mantenuto un normale aspetto istologico, anche dopo 10 giorni di coltura. Nelle sezioni degli emi-follicoli della metà superiore, abbiamo invariabilmente rilevato una regione di intensa proliferazione cellulare attorno alla porzione inferiore del follicolo: le cellule proliferanti hanno dato origine a strutture somiglianti ad una papilla follicolare rigenerata, suggerendo che gli emi-follicoli della metà superiore potrebbero così essere capaci di rigenerare un follicolo completo e vitale.
DISCUSSIONE
Si ritiene che tutti i tessuti auto-rinnovatisi contengano una popolazione di cellule staminali. Il follicolo del capello è un sistema auto-rinnovantesi nel quale la perdita delle cellule epiteliali, dovuta alla differenziazione terminale, è bilanciata dalla formazione continua di nuove cellule (3). Alcune osservazioni hanno suggerito come le cellule germinali del follicolo siano situate sia nel bulbo sia in prossimità della bulge area della radice, vicino l’inserzione del muscolo erector pili. A questo proposito, vale la pena notare che dal momento che essendo riassorbita e rigenerata durante ogni ciclo del capello, la regione inferiore del follicolo (porzione sottostante la bulge area) è transitoria, mentre la porzione superiore del follicolo rimane intatta durante tutto il ciclo del capello. Un’ implicazione di questa ipotesi è che il movimento cellulare nella guaina esterna della radice si verifichi per lo più verso il basso piuttosto che verso l’alto della matrice. Inoltre, il concetto che le cellule staminali risiedano anche nella regione vicina al bulge, aiuta a capire alcuni aspetti della patologia del follicolo; nell’alopecia cicatriziale, per esempio, l’infiltrato infiammatorio interessa la parte superiore del follicolo estendendosi fino all’inserzione dell’erettore, includendo così una delle regioni putative di cellule staminali (12). D’accordo con questa ipotesi, Oliver (6) ha dimostrato che le vibrisse del topo possono rigenerare dopo che è stato rimosso chirurgicamente il terzo inferiore del follicolo; l’esame morfologico del follicolo rigenerato ha rivelato che si forma una nuova papilla dermica, originatasi apparentemente dalla guaina del rimanente tessuto connettivo. Allo stesso modo, Inaba et al. (4), Kim e Choi hanno osservato clinicamente come follicoli, dai quali il bulbo e l’intera papilla sono stati escissi, hanno rigenerato nuove papille e permesso la crescita di nuovi capelli. Pertanto queste osservazioni dimostrano come la metà superiore di un follicolo pilifero possa essere caratterizzata da capacità rigenerative fino ad oggi attribuite solo al bulbo. In questo studio sono state riportate le percentuali di sopravvivenza e di crescita di follicoli piliferi umani bisezionati, osservate utilizzando un modello in vitro affidabile, riproducibile e quantificabile. I dati ottenuti concordano con quanto è stato descritto da Rochat et al. (13) e Kobayashi et al. (14). Esaminando la capacità di accrescimento di cheratinociti isolati da follicoli piliferi umani e vibrisse di topo, essi hanno determinato la posizione delle cellule atte alla formazione di colonie di cheratinociti, scoprendo che le cellule suddette si localizzano soprattutto a livello del bulge follicolare o immediatamente al di sotto della stessa. Secondo la nostra esperienza, le cellule follicolari attive per la formazione di colonie possono pertanto essere considerate come cellule staminali follicolari. A nostro avviso la percentuale riportata di sopravvivenza in vitro dei follicoli sezionati potrebbe essere un interessante punto di partenza per lo sviluppo di ulteriori studi clinici su questa metodica. Sia i follicoli intatti che quelli della metà inferiore hanno dimostrato una percentuale di crescita molto simile a quella che si ha in vivo, circa 0,3 mm al giorno, mentre gli emi-follicoli della metà superiore hanno mostrato una minor capacità produttiva. La bassa percentuale di crescita dei follicoli della metà superiore potrebbe essere correlata al fatto che un certo intervallo di tempo sia richiesto dalle cellule staminali della bulge area per generare la struttura istologicamente osservata, che ricorda una papilla follicolare rigenerata e per promuovere quindi la crescita di una nuova guaina.
CONCLUSIONI
Secondo i risultati ottenuti, un’interessante ipotesi speculativa è rappresentata dalla possibilità di ricreare un’intera struttura follicolare da singole cellule staminali follicolari. In questo caso, potrebbe essere eventualmente possibile coltivare cellule staminali follicolari in grado di offrire ai singoli pazienti una quantità pressochè infinita di cellule staminali potenzialmente capaci di generare follicoli. Questioni irrisolte che emergono dal nostro studio in vitro di 10 giorni sono se la sopravvivenza e la crescita dei follicoli bisezionati, così come osservato in vitro, possano essere le stesse quando gli emi-follicoli siano innestati come in una normale tecnica di trapianto di capelli, e quale possa essere il comportamento a lungo termine di questo tipo di innesti. Dal momento che, sfortunatamente, il massimo periodo di sopravvivenza osservato per i capelli coltivati è vicino ai 10 giorni, uno studio clinico della metodica in oggetto risulta essere indispensabile per consentire un effettivo follow-up a lungo termine di questa tecnica.
Bibliografia
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